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ELISA實(shí)驗(yàn)中如何精確判斷顯色時(shí)長(zhǎng),TMB顯色

2022-06-20
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監(jiān)控OD620數(shù)據(jù)精確控制TMB顯色法

原理:

TMB顯色劑主要成分是二,二甲基聯(lián)苯胺(非致癌HRP底物),氧化失去電子后變成電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物(TMB+TMB,復(fù)合物最大吸收峰652nm(藍(lán)色),當(dāng)加入酸性物質(zhì)后導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物質(zhì)子化,迫使兩者分離出一分子的TMB(無色),一分子TMB+(黃色琨,最大吸收峰450nm),同時(shí)酸性條件下HRP酶失活,顯色停止。

因此652的數(shù)據(jù)正向?qū)?yīng)450的數(shù)據(jù),(實(shí)驗(yàn)室使用620nm相對(duì)652誤差10%)。

監(jiān)控的OD620(藍(lán)色)和終止后對(duì)照450表格

部分項(xiàng)目顯色控制情況:

顯色控制,精確計(jì)算注意事項(xiàng):

1、酶標(biāo)儀讀取TMB+
450nm
的最佳設(shè)備分辨率是3.0以下,在2.2以下有非常好的線性(2倍關(guān)系)。如果是定量,顯色不易過深,參考數(shù)據(jù)為Thermo FC酶標(biāo)儀提供。注意:不同廠家的酶標(biāo)儀靈敏度存在差異。

2、使用專業(yè)的曲線軟件,推薦軟件可以在菲恩網(wǎng)站下載(技術(shù)支持-下載),如果是拋物線建議使用四參數(shù)方程(MMF)計(jì)算。

3、顯色過深后(OD4503.5),TMB+濃度較高,其溶解性大大低于TMB,會(huì)緩慢形成結(jié)晶并沉淀在孔底部(黑色針狀顆粒),黃色會(huì)消退,應(yīng)立即讀數(shù)。過深的顯色會(huì)在12小時(shí)后在孔底部出現(xiàn)大量黑色結(jié)晶,而無法保留黃色。