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實(shí)驗(yàn)指南

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FC實(shí)驗(yàn)操作流程

2022-06-20
914次

FC實(shí)驗(yàn)步驟

一、細(xì)胞表面染色操作流程

1、細(xì)胞計(jì)數(shù):將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù);500g離心4min,去上清;

2、制備單細(xì)胞懸液:將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復(fù)2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個(gè)細(xì)胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細(xì)胞懸液;

3、(可選)阻斷Fc受體:室溫孵育10-20min;

4、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應(yīng)30min;

5、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

6、二抗孵育:對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應(yīng)30min。對(duì)于直標(biāo)抗體直接跳到步驟8;

7、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞,4℃保存,上機(jī)分析。

二、細(xì)胞胞內(nèi)染色操作流程

1、細(xì)胞計(jì)數(shù):將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集于15mL離心管并計(jì)數(shù);500g離心4min,去上清;

2、制備單細(xì)胞懸液:將收集的細(xì)胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復(fù)2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞至濃度1x106個(gè)細(xì)胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細(xì)胞懸液,400g離心5min去上清;

3、固定:每孔加入100μl細(xì)胞固定劑重懸細(xì)胞,2-8°孵育20min;

4、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

5、通透:每孔加入100μl細(xì)胞通透劑重懸細(xì)胞,室溫孵育20min;

6、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

7、(可選)阻斷Fc受體:10-20min;

8、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應(yīng)30min;

9、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

10、二抗孵育:對(duì)于非熒光染料直標(biāo)抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應(yīng)30min。對(duì)于直標(biāo)抗體直接跳到步驟11;

11、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復(fù)兩遍;

12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細(xì)胞,4℃保存,上機(jī)分析。


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