在蛋白和抗體純化工作中，如何準(zhǔn)確的進(jìn)行定量一直是一個(gè)棘手的問(wèn)題。傳統(tǒng)的方如Bradford，BCA等操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，而通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的紫外吸收來(lái)定量，則非?？焖俜奖?。

蛋白質(zhì)擁有的紫外吸收性質(zhì)是來(lái)自芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸分子內(nèi)含有共軛雙鍵，在280納米波長(zhǎng)附近具有最大的光吸收峰。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)均含有酪氨酸、色氨酸殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)在280納米波長(zhǎng)處的吸光度，是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的一種最快速簡(jiǎn)便的方法。

其優(yōu)點(diǎn)是快速，對(duì)樣品無(wú)破壞，缺點(diǎn)在于此法是根據(jù)酪氨酸（Tyr），苯丙氨酸（Phe），色氨酸（Trp）殘基的強(qiáng)吸收值來(lái)測(cè)定的，不同的蛋白質(zhì)其含量不同，所以當(dāng)?shù)鞍字腥狈@幾種氨基酸時(shí)，定量就不準(zhǔn)了，就得考慮其他方法。另外核酸，和其他所有含有苯環(huán)共軛π鍵的物質(zhì)（如蛋白洗脫用的咪唑）都會(huì)影響其定量，在測(cè)定前應(yīng)先透析除去。

一、如何利用微量分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定蛋白濃度

01  首先打開(kāi)軟件，選擇Protein A280。

02  再在右上角選擇樣品的類(lèi)型，1Abs=1mg/ml為測(cè)定未知蛋白的選項(xiàng)（如果是測(cè)試抗體濃度，可以選擇igG預(yù)設(shè)參數(shù)，大部分廠家的設(shè)備都含有這個(gè)參數(shù)）。

03  然后用純水將比色皿清洗三次，選擇合適的溶液作為背景，滴入2μl，按blank減去背景。再用純水將比色皿清洗三次，滴入2μl樣品，按measure測(cè)定。下方就會(huì)顯示樣品的A280值即為濃度。

04  到這一步還沒(méi)完！

還需要到https://web.expasy.org/protparam/，上輸入蛋白的序列來(lái)查找消光系數(shù)，用測(cè)得的A280除以該蛋白的消光系數(shù)，才是最終的準(zhǔn)確濃度。

菲恩生物嚴(yán)格把控每一個(gè)生產(chǎn)的蛋白或抗體產(chǎn)品的質(zhì)量，質(zhì)控方面使用傳統(tǒng)的SDS-Page膠染色,對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品濃度的BSA蛋白，確定濃度和純度，同時(shí)參考全進(jìn)口微量分光光度計(jì)以獲得最準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，讓產(chǎn)品在純度和濃度上不會(huì)出現(xiàn)偏差。

二、舉例菲恩生產(chǎn)蛋白驗(yàn)證的過(guò)程的結(jié)果圖(DOG43為蛋白編號(hào))

01  12%SDS-PAGE驗(yàn)證（其中BSA標(biāo)準(zhǔn)品為1mg，上樣10ul）

02  DOG43蛋白序列進(jìn)行分析，計(jì)算消光系數(shù)。

03  微量分光光度計(jì)濃度測(cè)定結(jié)果。