怎樣制備高質(zhì)量的抗體—?jiǎng)游锩庖哂忻钫?/h1>

2022-06-20

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傳統(tǒng)的抗體制備都是從抗原刺激免疫動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答開始，其中單克隆抗體是從免疫動(dòng)物脾臟取B細(xì)胞與無限增殖的瘤細(xì)胞體外融合，對(duì)融合成功的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，從而根據(jù)應(yīng)用目的篩選對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株，然后通過細(xì)胞培養(yǎng)或收集腹水進(jìn)一步純化得到抗體；而多克隆抗體是采集動(dòng)物抗血清，直接親和純化得到抗體。不管是哪種抗體的制備，都離不開高效的動(dòng)物免疫。

單克隆抗體的制備流程示意圖多克隆抗體的制備流程示意圖

    動(dòng)物免疫利用的是生物體自身的體液免疫應(yīng)答機(jī)制，通過抗原的持續(xù)刺激先后啟動(dòng)初級(jí)免疫反應(yīng)和次級(jí)免疫反應(yīng)，實(shí)際操作中以血清中抗體效價(jià)來衡量實(shí)際免疫效果。抗原刺激機(jī)體后啟動(dòng)初級(jí)反應(yīng)一般會(huì)有一個(gè)滯后期，此時(shí)幼B細(xì)胞經(jīng)過克隆篩選、增殖，然后分化成記憶細(xì)胞或漿細(xì)胞。經(jīng)過滯后期，血清效價(jià)呈指數(shù)增長(zhǎng)達(dá)到一個(gè)峰值然后下降。初級(jí)免疫反應(yīng)中，會(huì)首先分泌IgM，然后經(jīng)過抗體亞型轉(zhuǎn)換，IgG比例會(huì)升高。

次級(jí)免疫反應(yīng)的啟動(dòng)依賴于記憶B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的數(shù)目，記憶細(xì)胞再次遇到相同抗原就能被激活，從而導(dǎo)致次級(jí)免疫反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)記憶細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)大于幼B細(xì)胞時(shí)，次級(jí)反應(yīng)啟動(dòng)更快、強(qiáng)度更大。次級(jí)反應(yīng)相比初級(jí)反應(yīng)滯后期更短，漿細(xì)胞和血清效價(jià)的峰值更高，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。同時(shí)，此時(shí)分泌的抗體經(jīng)過親和力成熟和亞型轉(zhuǎn)換，質(zhì)量更高。

一般免疫進(jìn)程中血清效價(jià)變化曲線示意圖

動(dòng)物免疫一般選擇健康的年青成年雄性動(dòng)物，免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟且不受性周期的影響而發(fā)生波動(dòng)。為確保動(dòng)物在整個(gè)免疫進(jìn)程中的健康無疫病狀態(tài)，除了對(duì)動(dòng)物來源有要求外，飼養(yǎng)環(huán)境也需進(jìn)行控制。嚴(yán)格來說，動(dòng)物需飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)施嚴(yán)格的微生物和寄生蟲控制。

菲恩生物免疫基地小鼠飼養(yǎng)SPF級(jí)車間和兔飼養(yǎng)潔凈區(qū)

    通?？乖枰扔米魟┤榛笤傩凶⑸洌贵w制備中最常用的弗氏佐劑主要成分為礦物油和羊毛脂，其中首次免疫需使用添加卡介苗或滅活的結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑。佐劑的作用主要是延緩抗原的釋放，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬和對(duì)抗原的呈遞?？乖瓨O為寶貴時(shí)可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射，此時(shí)可不使用佐劑，抗原只需10～100μg。

開始一項(xiàng)免疫，除了上面提到的通用性原則，還需要考慮動(dòng)物種屬的選擇、免疫劑量的使用、注射方式以及間隔時(shí)間的控制。

01、抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好；親緣關(guān)系太近，意味著抗原同源性高不被免疫系統(tǒng)識(shí)別；另外，要注意有些抗原在免疫某些種類動(dòng)物時(shí)免疫原性極差，如胰島素對(duì)家兔、多種酶類（如胃蛋白酶原等）對(duì)山羊等，免疫時(shí)皆不易出現(xiàn)抗體。

02、免疫劑量應(yīng)根據(jù)抗原性強(qiáng)弱、分子量大小和免疫時(shí)間做相應(yīng)調(diào)整?？乖慷啵瑫r(shí)間間隔長(zhǎng)，劑量可適當(dāng)加大。大動(dòng)物抗原劑量（以蛋白抗原為準(zhǔn)）約0.5～1mg/只，小動(dòng)物約0.1～0.6mg/只。有時(shí)主觀希望加強(qiáng)免疫效果而不適當(dāng)?shù)丶哟髣┝?，往往?huì)弄巧成拙。

03、 免疫注射的途徑有多種，包括足掌、肘窩、頸背部等淋巴結(jié)密集區(qū)皮下和皮內(nèi)注射，另外還有肌肉注射和靜脈注射。最廣泛使用的是皮下注射方式，某些情形下皮內(nèi)注射有優(yōu)勢(shì)。

常見的免疫注射途徑

04、免疫間隔時(shí)間也是重要因素，特別是首次與第二次之間更應(yīng)注意。第一次免疫后，一般以間隔10～20天為好。二次以后每次的間隔一般為7～10天，不能太長(zhǎng)，以防刺激變?nèi)?，抗體效價(jià)不高。免疫的總次數(shù)多為5～8次，半抗原需經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的免疫才能產(chǎn)生高效價(jià)抗體，有時(shí)總時(shí)間為一年以上。

建議：實(shí)際操作中，免疫劑量、免疫部位以及間隔時(shí)間的組合都會(huì)對(duì)免疫結(jié)果產(chǎn)生較大影響，需對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行監(jiān)控，根據(jù)實(shí)際的免疫效果調(diào)整，不可生搬硬套。

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