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怎樣制備高質(zhì)量的抗體—動物免疫有妙招

2022-06-20
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傳統(tǒng)的抗體制備都是從抗原刺激免疫動物產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答開始,其中單克隆抗體是從免疫動物脾臟取B細胞與無限增殖的瘤細胞體外融合,對融合成功的雜交瘤細胞進行亞克隆,從而根據(jù)應(yīng)用目的篩選對應(yīng)的細胞株,然后通過細胞培養(yǎng)或收集腹水進一步純化得到抗體;而多克隆抗體是采集動物抗血清,直接親和純化得到抗體。不管是哪種抗體的制備,都離不開高效的動物免疫。

單克隆抗體的制備流程示意圖多克隆抗體的制備流程示意圖

    動物免疫利用的是生物體自身的體液免疫應(yīng)答機制,通過抗原的持續(xù)刺激先后啟動初級免疫反應(yīng)和次級免疫反應(yīng),實際操作中以血清中抗體效價來衡量實際免疫效果??乖碳C體后啟動初級反應(yīng)一般會有一個滯后期,此時幼B細胞經(jīng)過克隆篩選、增殖,然后分化成記憶細胞或漿細胞。經(jīng)過滯后期,血清效價呈指數(shù)增長達到一個峰值然后下降。初級免疫反應(yīng)中,會首先分泌IgM,然后經(jīng)過抗體亞型轉(zhuǎn)換,IgG比例會升高。

次級免疫反應(yīng)的啟動依賴于記憶B細胞和記憶T細胞的數(shù)目,記憶細胞再次遇到相同抗原就能被激活,從而導(dǎo)致次級免疫反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)記憶細胞數(shù)目遠大于幼B細胞時,次級反應(yīng)啟動更快、強度更大。次級反應(yīng)相比初級反應(yīng)滯后期更短,漿細胞和血清效價的峰值更高,持續(xù)時間更長。同時,此時分泌的抗體經(jīng)過親和力成熟和亞型轉(zhuǎn)換,質(zhì)量更高。

一般免疫進程中血清效價變化曲線示意圖

動物免疫一般選擇健康的年青成年雄性動物,免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟且不受性周期的影響而發(fā)生波動。為確保動物在整個免疫進程中的健康無疫病狀態(tài),除了對動物來源有要求外,飼養(yǎng)環(huán)境也需進行控制。嚴(yán)格來說,動物需飼養(yǎng)于SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi),實施嚴(yán)格的微生物和寄生蟲控制。

菲恩生物免疫基地小鼠飼養(yǎng)SPF級車間和兔飼養(yǎng)潔凈區(qū)

    通??乖枰扔米魟┤榛笤傩凶⑸?,抗體制備中最常用的弗氏佐劑主要成分為礦物油和羊毛脂,其中首次免疫需使用添加卡介苗或滅活的結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑。佐劑的作用主要是延緩抗原的釋放,增強吞噬細胞的吞噬和對抗原的呈遞。抗原極為寶貴時可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射,此時可不使用佐劑,抗原只需10~100μg。

開始一項免疫,除了上面提到的通用性原則,還需要考慮動物種屬的選擇、免疫劑量的使用、注射方式以及間隔時間的控制。

01、抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好;親緣關(guān)系太近,意味著抗原同源性高不被免疫系統(tǒng)識別;另外,要注意有些抗原在免疫某些種類動物時免疫原性極差,如胰島素對家兔、多種酶類(如胃蛋白酶原等)對山羊等,免疫時皆不易出現(xiàn)抗體。

02、免疫劑量應(yīng)根據(jù)抗原性強弱、分子量大小和免疫時間做相應(yīng)調(diào)整。抗原量多,時間間隔長,劑量可適當(dāng)加大。大動物抗原劑量(以蛋白抗原為準(zhǔn))約0.5~1mg/只,小動物約0.1~0.6mg/只。有時主觀希望加強免疫效果而不適當(dāng)?shù)丶哟髣┝?,往往會弄巧成拙?/p>

03、 免疫注射的途徑有多種,包括足掌、肘窩、頸背部等淋巴結(jié)密集區(qū)皮下和皮內(nèi)注射,另外還有肌肉注射和靜脈注射。最廣泛使用的是皮下注射方式,某些情形下皮內(nèi)注射有優(yōu)勢。

常見的免疫注射途徑

04、免疫間隔時間也是重要因素,特別是首次與第二次之間更應(yīng)注意。第一次免疫后,一般以間隔10~20天為好。二次以后每次的間隔一般為7~10天,不能太長,以防刺激變?nèi)?,抗體效價不高。免疫的總次數(shù)多為5~8次,半抗原需經(jīng)長時間的免疫才能產(chǎn)生高效價抗體,有時總時間為一年以上。

建議:實際操作中,免疫劑量、免疫部位以及間隔時間的組合都會對免疫結(jié)果產(chǎn)生較大影響,需對抗血清效價進行監(jiān)控,根據(jù)實際的免疫效果調(diào)整,不可生搬硬套。